人神经干细胞培养与诱导成脑类器官的方法

神经干细胞培养基的准备

首先，制备神经干细胞（NSC）扩增的完全培养基。补充NSC补充剂及L-丙氨酰-谷氨酰胺，以确保细胞在培养过程中的健康生长。在无菌环境中，首先向480mL NSC培养基中依次加入20mL NSC补充剂和5mL 200mM L-丙氨酰-谷氨酰胺，所得即为NSC扩增完全培养基。在所选的培养基中，可选择性地添加10mL/L的抗生素（如青霉素-链霉素）以防止细菌污染。所有成分需按照有效期限存放于2°C至8°C条件下，避免光照，以保证稳定性可达4周。

孔板包被步骤

在使用即用型基质胶包被孔板时，取出6孔板或12孔板，每孔中加入相应体积的基质胶，轻轻摇晃使其完全覆盖底部。之后在37℃培养箱中孵育1至2小时，待实验前需在超净工作台中室温平衡20分钟。如暂时不使用，可用Parafilm密封并在2-8℃下保存1周。

神经干细胞传代过程

待细胞密度达到90-100%时，丢弃培养瓶中培养基，并用5mL不含钙镁的DPBS洗涤细胞，以去除残余培养基。随后在每个培养瓶中加入10mL预热的人多能干细胞消化液，在室温下孵育2至5分钟，确保液体完全覆盖细胞。使用倒置显微镜观察细胞是否开始脱离，必要时轻拍培养瓶以促进脱离。接着，将细胞悬液与预热的NSC完全培养基混合，离心200×g 4分钟，弃上清后重悬细胞沉淀并计数。

神经干细胞冻存

在进行细胞冻存前，需准备专用的干细胞冻存液。按照既定的传代步骤收集细胞，按2×10⁶个活细胞/mL的密度计算冻存所需体积。重悬细胞后，加入等量冻存液，使DMSO终浓度为10%。然后将细胞悬液等分装入冻存瓶内，按照标准程序缓慢降低温度并转移至液氮.

神经干细胞复苏过程

复苏时，迅速将冻存管放入37°C水浴中解冻。解冻后，将冻存液转移至无菌离心管中并重悬在预热的NSC完全培养基中，接着进行轻柔的混合。离心后，重悬细胞沉淀后加入Y27632以帮助细胞生存。

诱导形成脑类器官

在诱导成脑类器官时，需准备仪器设备，包括CO2培养箱、超净台、倒置显微镜等。使用动物脑类器官培养基，结合低因子、无酚红的基质胶，并按既定的加入顺序进行点板和培养。细胞的接种密度及流程均需量化控制，以确保形成健康的类器官。在进行传代或冻存时，要注意基质胶的选择及相关的混合密度，促进类器官的有效生长与分化。

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